Setelah berakhirnya kemelut ini tampilah Ratu Kalinyamat penguasa di Jepara dan Pangeran Hadiwijaya di Pajang pada tahun 1549. Adapun identitas kedua tokoh ini yaitu Ratu Kalinyamat adalah puteri kandung dari Sultan Trenggono sedangkan Pangeran Hadiwijaya adalah putera menantu Sultan Trenggono pula. Pada masa pemerintahan Ratu Kalinyamat, Jepara berkembang pesat menjadi Bandar Niaga utama di Pulau Jawa, yang melayani ekspor impor. Di samping itu juga menjadi pangkalan angkatan laut yang telah dirintis sejak masa kerajaan Demak.Hari jadi Jepara telah ditetapkan tanggal 10 April 1549 berdasarkan Peraturan Daerah Tingkat II Jepara Nomor 9 Tahun 1988, tentang Penetapan Hari Jadi Jepara. Adapun penetapan peraturan daerah ini mengacu pada tokoh Putri Retno Kencono yang dinobatkan selaku penguasa Jepara dengan nama “NIMAS RATU KALINYAMAT” secara singkat tokoh wanita sejarah legendaris ini dapat diuraikan sebagai berikut :

Setelah tewasnya Sultan Trenggono dari Kerajaan Demak dalam Ekspedisi Militer di Panarukan Jawa Timur pada tahun 1546, timbulnya geger perebutan tahta kerajaan Demak yang berakhir dengan tewasnya Pangeran Prawoto dari Demak, disusul Pangeran Hadlirin dari Jepara dan Pangeran Aryo Penangsang dari Jipan Panolan.

Sebagai seorang Penguasa Jepara, yang gemah ripah loh jinawi karena keberadaan Jepara kala itu sebagai Bandar niaga yang ramai, Ratu Kalinyamat dikenal mempunyai jiwa patriotisme anti penjajahan. Hal ini dibuktikan dengan pengiriman armada perangnya ke Malaka guna menggempur Portugis pada tahun 1551 dan tahun 1554. Adalah tidak berlebihan jika orang Portugis saat itu menyebut Sang Ratu sebagai “RAINHA DE JEPARA ”SENORA PADE ROSA DE RICA”, yang artinya Raja Jepara seorang wanita yang sangat berkuasa dan kaya raya.
Serangan sang Ratu yang gagah berani ini melibatkan hampir 40 buah kapal yang berisikan lebih kurang 5.000 orang prajurit. Namus serangan ini gagal ketika prajurit Kalinyamat ini melakukan serangan darat dalam upaya mengepung benteng pertahanan Portugis di Malaka, tentara Portugis dengan persenjataan lengkap berhasil mematahkan kepungan tentara Kalinyamat.
Namun semangat patriotisme sang Ratu tidak pernah luntur dan gentar menghadapi penjajah bangsa Portugis, yang di abad 16 itu sedang dalam puncak kejayaan dan diakui sebagai bangsa pemberani di dunia.
Duapuluh empat tahun kemudian atau tepatnya Oktober 1574, Sang Ratu Kalinyamat mengirimkan armada militernya yang lebih besar di Malaka. Ekspedisi militer kedua ini melibatkan 300 buah kapal diantaranya 80 buah kapal jung besar berawak 1500 orang prajurit pilihan. Pengiriman armada militer kedua ini dipimpin oleh Panglima terpenting dalam kerajaan yang disebut orang Portugis sebagai “QUILIMO”.
Walaupun ahirnya perang kedua ini yang berlangsung berbulan-bulan tentara Kalinyamat juga tidak berhasil mengusir Portugis dari Malaka, namun telah membuat Portugis takut dan jera berhadapan dengan Raja Jepara ini, terbukti dengan bebasnya Pulau Jawa dari penjajahan Portugis di abad 16 itu.
Sebagai peninggalan sejarah dari perang besar antara Jepara dan Portugis, sampai sekarang masih terdapat di Malaka komplek kuburan yang disebut sebagai Makam Tentara Jawa. Selain daripada itu tokoh Ratu Kalinyamat ini juga sangat berjasa dalam membudayakan SENI UKIR yang sekarang ini jadi andalan utama ekonomi Jepara yaitu perpaduan seni ukir Majapahit dengan seni ukir Patih Badarduwung yang berasal dari Negeri Cina.
Menurut catatan sejarah Ratu Kalinyamat wafat pada tahun 1579 dan dimakamkan di desa mantingan Jepara, di sebelah makam suaminya Pangeran Hadlirin. Mengacu pada semua aspek positif yang telah dibuktikan oleh Ratu Kalinyamat sehingga Jepara menjadi negeri yang makmur, kuat, dan mashur, maka penetapan Hari Jadi Jepara yang mengambil waktu Beliau dinobatkan sebagai penguasa Jepara atau yang bertepatan dengan tanggal 10 April 1549 ini telah ditandai dengan candra sengkala “TRUS KARYA TATANING BUMI” atau terus bekerja membangun daerah.Sumber web